L'analyse de séquence de Sanger - une explication claire

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En 1977, le premier génome d'un bactériophage a été séquencé. De ce fait, la séquence de bases exacte de l'ADN viral a été découverte. Aujourd'hui, quelques décennies plus tard, grâce à la dernière séquence analyses même les génomes des organismes complexes tels que l'homme sont parfaitement connus. Le séquençage initial développée par Sanger et Coulson et est aussi appelée la synthèse de terminaison de chaîne. Mais comment l'analyse de la séquence de Sanger fait dans le détail?

Pour la méthode de terminaison de chaîne vous devez ADN simple brin. Il se agit de l'acide nucléique à séquencer est incorporé dans un vecteur. Par la suite, ce mode miroir synthétisé par réaction différentes étapes brins d'ADN de différentes longueurs appropriées.

Chaîne méthode de terminaison - L'analyse de la séquence classique de Sanger-Coulson

  1. Première partie, l'ADN à séquencer est enzymatiquement incorporé dans le vecteur M13. En outre, une construction d'ADN enzymatique et un court oligonucleotide qui ne est que de quelques paires de bases en longueur. Ce est le point de départ pour la synthèse du brin spéculaire brin d'ADN.
  2. Dans l'étape suivante de l'analyse de la séquence de Sanger sont employés la réaction dans chaque cas l'un des quatre didésoxynucléotides ajoutés. Ceux-ci sont marqués de manière radioactive ou avec un colorant fluorescent et par ailleurs de la même main utilisée lorsque la construction d'ADN naturel nucleotides d'adénosine, cytidine, guanosine et thymidine. Contrairement à leurs ennemis naturels dieDidesoxynukleotide ne ont pas de groupe 3'-OH. Cependant, ce est nécessaire d'établir un brin d'ADN continue, ce est à dire de lier la prochaine nucléotides avec la fin de celui-ci tranges. En conséquence, la synthèse de brin se arrête après demEinbau un didésoxynucléotide. Cette résiliation est éponyme pour la méthode de terminaison de chaîne.
  3. Il ne est pas possible de prédire quand un didésoxynucléotide est incorporé dans le nouveau brin d'ADN et abandonne. Par conséquent, dans chacun des quatre mélanges réactionnels différents résultats en longs fragments d'ADN qui se terminent par un didésoxy-adénosine, cytidine, guanosine ou thymidine.

L'analyse de séquence de Sanger - Le Résultat

A la fin de l'analyse de la séquence classique de Sanger obtenu quatre réactions, chacune avec un mélange de fragments d'ADN de longueur différente. Ces mélanges sont séparés par Split adénosine, cytidine, thymidine et guanosine sur un gel ou dans les capillaires. Étant donné que les didésoxynucléotides sont marqués radioactivement ou par des colorants fluorescents différents, les fragments d'ADN peuvent être visualisées. L'information est recueillie par un laser et le détecteur, un ordinateur et ensuite calculé à partir des données de fluorescence, la séquence exacte de bases dans la molécule d'ADN. Ainsi, le chercheur sera la présentation de la séquence de bases dans le génome à examiner.

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